附件：乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2025年修訂版）（2025年第4號(hào)）.doc

乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)審查
指導(dǎo)原則（2025年修訂版）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用實(shí)時(shí)熒光 PCR法，對(duì)人血清、血漿樣本中的乙型肝炎病毒進(jìn)行基因分型的檢測(cè)試劑。

對(duì)于采用其他分子生物學(xué)方法或其他樣本類型的乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人可參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，并補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料。

HBV屬嗜肝DNA病毒科，基因組長(zhǎng)約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。根據(jù)全基因組序列差異>8%或S基因序列差異>4%的標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為不同的基因型。目前HBV至少有9 種（A 型至I 型）基因型和1種未定基因型（J 型）。

不同基因型的HBV在耐藥性、致病力及基因突變頻率等方面存在一定差別，導(dǎo)致不同基因型HBV感染者的疾病嚴(yán)重程度、藥物治療反應(yīng)和最終結(jié)局不同，因此在確認(rèn)HBV感染后進(jìn)行基因型檢測(cè)有助于指導(dǎo)臨床選擇用藥。

本指導(dǎo)原則適用于乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)申請(qǐng)和變更注冊(cè)申請(qǐng)的情形。本指導(dǎo)原則僅針對(duì)乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類目錄》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測(cè)流程。提供不同適用機(jī)型的檢測(cè)通量，即一次檢測(cè)最多可檢測(cè)的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣?dòng)提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測(cè)全過(guò)程所需的時(shí)間。不同檢測(cè)流程，分別提供最少和最多檢測(cè)樣本量下的檢測(cè)時(shí)間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較應(yīng)著重從方法學(xué)及不同基因型檢出能力等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測(cè)原理，檢測(cè)靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料及生產(chǎn)工藝要求。

如已有相應(yīng)型別的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)要求。

如果有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2. 分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

分析性能評(píng)估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數(shù)據(jù)等。分析性能評(píng)估所用的樣本，至少B、C、D型乙型肝炎病毒應(yīng)為真實(shí)樣本或病毒培養(yǎng)物，對(duì)于難以獲得的罕見(jiàn)型別可采用質(zhì)?；蚣俨《?。如涉及稀釋后檢測(cè)，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)進(jìn)行稀釋。對(duì)于各項(xiàng)性能中使用的樣本，在下述各項(xiàng)性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性研究包括采集后未經(jīng)處理的樣本和核酸提取純化后的DNA樣本，研究?jī)?nèi)容包括冷藏保存時(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。

2.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。

2.3準(zhǔn)確度

采用申報(bào)試劑與核酸測(cè)序或已上市產(chǎn)品，同時(shí)檢測(cè)臨床樣本，比較檢測(cè)結(jié)果之間的一致性程度，進(jìn)行申報(bào)試劑的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)。

樣本應(yīng)選擇符合樣本穩(wěn)定性的預(yù)期人群樣本。研究應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性和陽(yáng)性樣本，應(yīng)覆蓋常見(jiàn)的基因型別。

2.4企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案。

精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期。例如為期至少20天的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度、實(shí)驗(yàn)室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、檢出限水平樣本、中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/p>

陰性樣本：不含待測(cè)物或待測(cè)物濃度為零時(shí)，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：檢出限水平樣本陽(yáng)性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率為100%，且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

建議將不同來(lái)源的至少3例乙型肝炎病毒樣本分別梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復(fù)檢測(cè)不少于20次，將具有95%陽(yáng)性檢出率的濃度水平作為檢出限。

在進(jìn)行檢出限確定時(shí)申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測(cè)的乙型肝炎病毒的不同基因型分別進(jìn)行研究。

2.6.2檢出限的驗(yàn)證

另外選擇具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少3個(gè)臨床樣本或病毒培養(yǎng)物在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行至少20次重復(fù)檢測(cè)，應(yīng)達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率。

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測(cè)的乙型肝炎病毒的不同基因型的檢出限分別進(jìn)行驗(yàn)證。

應(yīng)提供詳細(xì)的病毒滴度/濃度的確定方法，同時(shí)應(yīng)詳細(xì)描述病毒樣本的確認(rèn)方法及驗(yàn)證結(jié)果。

2.7基因混合型的研究

該部分研究主要目的是考查申報(bào)試劑檢測(cè)不同濃度混合型樣本的能力。申請(qǐng)人應(yīng)設(shè)置不同濃度比例的混合型樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

因理想的不同濃度比例基因混合型樣本在臨床單位中難以收集，申請(qǐng)人可以使用臨床模擬樣本進(jìn)行驗(yàn)證。該部分樣本建議用核酸測(cè)序方法和/或其他已上市產(chǎn)品明確樣本中包含的所有基因型，同時(shí)應(yīng)使用核酸定量的方法確定不同基因型的濃度。

2.8分析特異性

2.8.1交叉反應(yīng)

用于乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：

核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。

申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測(cè)的不同基因型以及其他基因型乙型肝炎病毒對(duì)被檢測(cè)基因型的影響。對(duì)于難以獲得的基因型, 可采用針對(duì)該基因型構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

建議在病原體感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平對(duì)乙型肝炎病毒核酸陰性樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，病毒為105 PFU/mL或更高，細(xì)菌為106CFU/mL或更高。

申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來(lái)源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說(shuō)明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

2.8.2微生物干擾

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床上容易與乙型肝炎病毒合并感染的病原微生物以及申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)范圍外的不同基因型的乙型肝炎病毒，在高濃度的情況下對(duì)低濃度（例如檢出限濃度）被測(cè)基因型乙型肝炎病毒檢測(cè)的影響。

2.8.3競(jìng)爭(zhēng)性干擾

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床上常見(jiàn)存在的乙型肝炎病毒不同基因型混合感染情況，評(píng)價(jià)高濃度被測(cè)分析物對(duì)低濃度被測(cè)分析物檢測(cè)結(jié)果的影響。建議申請(qǐng)人結(jié)合申報(bào)試劑的反應(yīng)模式，使用一種基因型最低檢出限濃度的靶標(biāo)乙型肝炎病毒和另一種基因型高濃度靶標(biāo)乙型肝炎病毒評(píng)估競(jìng)爭(zhēng)性干擾，競(jìng)爭(zhēng)性干擾的乙型肝炎病毒基因型別組合建議為同一反應(yīng)體系內(nèi)常見(jiàn)不同基因型混合感染的乙型肝炎病毒。

2.8.4干擾物質(zhì)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對(duì)可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。

內(nèi)源性干擾物質(zhì)：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白G等。

外源性干擾物質(zhì)：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、富馬酸替諾福韋酯（TDF）、富馬酸丙酚替諾福韋酯（TAF）、艾米替諾福韋（TMF）等。

建議在乙型肝炎病毒的檢出限附近水平對(duì)每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測(cè)。干擾物濃度的分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)物質(zhì)無(wú)干擾的最高限值?！　?/p>

2.9核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，必要時(shí)可考慮與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對(duì)。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。

2.10反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積）和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測(cè)靈敏度。

提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3. 穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4. 陽(yáng)性判斷值研究

用于陽(yáng)性判斷值研究的樣本需具有多樣性和代表性，應(yīng)考慮不同年齡、地域、型別、不同感染階段等因素，盡量納入含有干擾物質(zhì)或其他易引起交叉反應(yīng)病原體的樣本。建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對(duì)申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。如采用其他方法對(duì)陽(yáng)性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說(shuō)明這種方法的合理性。對(duì)于此類試劑，正常人群及其他患病人群中一般不應(yīng)檢出HBV基因型。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，且檢測(cè)結(jié)果不具有可比性，需要對(duì)各樣本類型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證。

提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括樣本來(lái)源機(jī)構(gòu)、臨床診斷信息、性別、年齡等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過(guò)程；如主要原材料源于外購(gòu)，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議每種基因型的病毒設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對(duì)和功能性試驗(yàn)等方式，對(duì)病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，其中序列比對(duì)包括與已公布乙型肝炎病毒序列的比對(duì)，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對(duì)；功能性試驗(yàn)包括對(duì)不同來(lái)源、不同滴度/濃度的乙型肝炎病毒不同基因型別陽(yáng)性樣本，和不同的近緣病原體的檢測(cè)。通過(guò)篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗(yàn)等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對(duì)其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測(cè)的靶序列，可采用質(zhì)粒、假病毒等制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測(cè)的全過(guò)程，以對(duì)整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對(duì)照，可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請(qǐng)人需對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品建議采用滅活病毒的臨床樣本或病毒培養(yǎng)物，罕見(jiàn)型別可采用質(zhì)?；蚣俨《?。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽(yáng)性參考品：陽(yáng)性參考品應(yīng)包含申報(bào)產(chǎn)品聲稱能檢測(cè)的所有基因型，每個(gè)基因型應(yīng)設(shè)置不同濃度水平，至少設(shè)置兩個(gè)濃度水平（弱陽(yáng)性、中或強(qiáng)陽(yáng)性）；常見(jiàn)基因型陽(yáng)性參考品設(shè)置建議采用滅活病毒的血清/血漿。

陰性參考品：可采用經(jīng)確認(rèn)無(wú)目標(biāo)靶基因序列的樣本。陰性參考品可反映非特異擴(kuò)增或檢測(cè)過(guò)程，當(dāng)不存在目標(biāo)序列時(shí)不會(huì)得到相關(guān)信號(hào)。陰性參考品設(shè)置建議采用滅活的血清/血漿。

檢出限參考品：可采用95%陽(yáng)性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。應(yīng)針對(duì)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢出的所有基因型乙型肝炎病毒進(jìn)行設(shè)置。

精密度參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

1.試驗(yàn)方法

乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑目前主要供臨床醫(yī)生對(duì)慢性乙型肝炎患者設(shè)置臨床治療方案提供參考依據(jù)。隨著乙型肝炎基因型與肝炎病情關(guān)系的研究工作不斷深入，研究方法不斷改進(jìn)，新的研究成果可能將被轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床工作中。如乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑用于新的臨床用途，應(yīng)根據(jù)新的臨床用途特點(diǎn)設(shè)置具有針對(duì)性的臨床試驗(yàn)研究方案。

對(duì)比方法的選擇可以考慮以下幾方面：

1.1 如已有同類產(chǎn)品上市，應(yīng)選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用試驗(yàn)體外診斷試劑與之進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市同類產(chǎn)品之間的一致性。應(yīng)充分考慮已上市同類產(chǎn)品的型別選擇、靶序列選擇、檢出限等特性，確保對(duì)比試劑與申報(bào)試劑具有明確可比性。

1.2 如無(wú)已上市同類產(chǎn)品，申請(qǐng)人可采用核酸序列測(cè)定方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的對(duì)比方法，評(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果之間的一致性。臨床試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)對(duì)選用的測(cè)序方法做詳細(xì)介紹。

申請(qǐng)人應(yīng)提供以下關(guān)于測(cè)序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，需有臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)簽章確認(rèn)：

1.2.1 測(cè)序方法原理、測(cè)序儀型號(hào)、測(cè)序試劑及消耗品的相關(guān)信息。

1.2.2 測(cè)序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性實(shí)驗(yàn)等資料。引物設(shè)計(jì)應(yīng)合理涵蓋申報(bào)試劑擴(kuò)增的靶核酸區(qū)段、位點(diǎn)及所有突變類型。

1.2.3 對(duì)所選測(cè)序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是檢出限的確認(rèn)，建議將所選測(cè)序方法與申報(bào)試劑的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析。

1.2.4 測(cè)序方法應(yīng)建立合理的陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.5 提交有代表性的樣本測(cè)序圖譜及結(jié)果分析資料。

2.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開(kāi)展臨床試驗(yàn)。建議申請(qǐng)人在選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)時(shí)，應(yīng)考慮試驗(yàn)機(jī)構(gòu)之間的地域代表性，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉臨床試驗(yàn)方案。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)體外診斷試劑和對(duì)比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被剔除的樣本都應(yīng)記錄在案，并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

4.臨床試驗(yàn)對(duì)象選擇

4.1基因型方面的考慮

HBV病毒其基因具有顯著的多樣性，不同的地區(qū)和民族，HBV流行的基因型不同。境內(nèi)流行的HBV基因型主要為B型、C型，部分地區(qū)存在少數(shù)D 型，以及重組型基因C/D型、B/C型、B/D型等。而且，HBV基因型具有一定的地域差異，不同地區(qū)流行的HBV基因型也不盡相同。因此，在選擇HBV感染者病例時(shí)，首先應(yīng)根據(jù)HBV流行的情況，選擇能代表我國(guó)不同地區(qū)流行基因型的HBV感染者病例，以對(duì)試劑檢測(cè)我國(guó)流行的HBV病毒的能力進(jìn)行客觀科學(xué)的評(píng)價(jià)，選擇的基因型應(yīng)包括上述三種主要的基因型。

4.2病例選擇及樣本量

臨床試驗(yàn)的入組病例應(yīng)以確診的慢性乙型肝炎病毒感染者為主，涵蓋注冊(cè)申報(bào)試劑所聲稱的所有基因型。對(duì)于B型及C型基因型臨床樣本，建議每種基因型不少于200例臨床樣本；對(duì)于D型基因型及其他基因型臨床樣本，建議每種不少于30例陽(yáng)性病例。每種基因型臨床樣本應(yīng)來(lái)源于乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性的患者。如注冊(cè)申報(bào)試劑中包含其他基因型，應(yīng)結(jié)合這部分基因型在我國(guó)的流行病學(xué)特點(diǎn)，臨床應(yīng)用情況等綜合因素，對(duì)其臨床有效性進(jìn)行科學(xué)評(píng)估。

在樣本選擇時(shí)，應(yīng)注重患者來(lái)源的不同地域性，不同病情進(jìn)展，不同藥物治療方案等。同時(shí)應(yīng)選擇部分干擾樣本（交叉反應(yīng)樣本），對(duì)于干擾樣本的選擇，應(yīng)考慮到在檢測(cè)過(guò)程中容易產(chǎn)生干擾，可能造成假陽(yáng)性/假陰性的情況，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比方法的一致性評(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種方法的結(jié)果，評(píng)價(jià)指標(biāo)一般包括陽(yáng)性符合率/靈敏度、陰性符合率/特異度，Kappa值等，并計(jì)算相應(yīng)的95%置信區(qū)間。除進(jìn)行總體統(tǒng)計(jì)外，還應(yīng)針對(duì)各基因型進(jìn)行分層統(tǒng)計(jì)。

6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑的檢測(cè)結(jié)果有不一致的樣本，如有必要，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑或參考方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

7.臨床試驗(yàn)小結(jié)與報(bào)告的撰寫

根據(jù)《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，撰寫臨床試驗(yàn)小結(jié)與報(bào)告，并且滿足簽章等要求。臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑說(shuō)明書編寫應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于體外定性檢測(cè)已明確為乙型肝炎病毒核酸陽(yáng)性患者的血清、血漿等樣本中乙型肝炎病毒基因型。輔助醫(yī)療專業(yè)人員了解病人的乙型肝炎病毒基因型感染情況以及確定適當(dāng)?shù)闹委煼椒ā?/p>

1.2 乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑的基因型應(yīng)至少包括B型、C型、D型，如果申請(qǐng)人略去上述任意一種推薦的基因型，應(yīng)給出合理的解釋。

1.3 適用人群：確診的慢性乙型肝炎病毒感染者。

1.4 簡(jiǎn)要介紹乙型肝炎病毒基因型的特征，包括不同基因型的特征、常見(jiàn)亞型、不同基因型在地域及人群中的分布情況、不同基因型在臨床的應(yīng)用特點(diǎn)。

1.5 強(qiáng)調(diào)該試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等因素對(duì)患者治療進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

2.1 對(duì)試劑盒能夠檢測(cè)的所有基因型進(jìn)行詳細(xì)描述（靶序列長(zhǎng)度及來(lái)源區(qū)段、基因型及相關(guān)特征等），對(duì)引物及探針設(shè)計(jì)、不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。

2.2 核酸提取純化的方法、原理等。

2.3 試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號(hào)或注冊(cè)證號(hào)、備案號(hào)等信息。

4.【適用機(jī)型】

注明所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

5.【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性等，明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

6.【樣本要求】

6.1 樣本收集要求：如采集時(shí)間、采集順序等，是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）相關(guān)要求。

6.2 血液樣本應(yīng)當(dāng)說(shuō)明對(duì)采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說(shuō)明樣本采集、處理及保存方式。

6.3 樣本處理、運(yùn)送及保存：核酸提取前的預(yù)處理、運(yùn)送條件、保存條件及期限等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。

7.【檢驗(yàn)方法】

明確核酸提取用的體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽(yáng)性質(zhì)控品與待測(cè)樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機(jī)型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)品的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍，作為試驗(yàn)有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)樣本的擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行結(jié)果陰陽(yáng)性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽(yáng)性、復(fù)測(cè)、無(wú)效等所有情形。

9.【檢驗(yàn)方法的局限性】

9.1 該產(chǎn)品僅用于乙型肝炎病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性患者的臨床樣本檢測(cè)。

9.2 該產(chǎn)品僅用于不同基因型的定性檢測(cè)，不適用定量檢測(cè)。

9.3該產(chǎn)品未包含全部乙型基因型別。該產(chǎn)品僅用于產(chǎn)品說(shuō)明書預(yù)期用途所包含的已知基因型的檢測(cè)，不適用其他基因型及未知基因型的檢測(cè)。因此，當(dāng)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，并不能排除被檢測(cè)者帶有乙型肝炎病毒的其他基因位點(diǎn)。

9.4 該類產(chǎn)品基于檢測(cè)原理無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)乙型肝炎病毒基因重組型樣本的結(jié)果，無(wú)法對(duì)乙型肝炎病毒基因混合型樣本和重組型樣本進(jìn)行有效區(qū)分。

9.5 模板DNA質(zhì)量將影響該產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果。模板DNA 的質(zhì)量可能受樣本來(lái)源、采集過(guò)程、運(yùn)輸條件、樣本處理等因素影響，同時(shí)也受DNA提取方法、PCR儀類型、操作環(huán)境以及當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的局限性等的限制，可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的檢測(cè)結(jié)果。使用者須了解檢測(cè)過(guò)程中可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

9.6 該產(chǎn)品以乙型肝炎病毒基因上的特定DNA片段為檢測(cè)靶標(biāo)，如試劑盒引物與探針結(jié)合區(qū)出現(xiàn)基因突變，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果異常，將影響檢測(cè)結(jié)果解釋。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)：

10.1檢出限：說(shuō)明試劑對(duì)不同樣本類型及不同基因型的檢出限，簡(jiǎn)要介紹檢出限的確定方法以及對(duì)檢出限驗(yàn)證所采用的基因型。如不同基因型之間檢出限不同，應(yīng)分別列出。

10.2 精密度：精密度參考品的組分、濃度及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)結(jié)果。

10.3 特異性：

10.3.1交叉反應(yīng)：

易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體以及乙型肝炎病毒其他基因型的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過(guò)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

10.3.2干擾物質(zhì)：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

10.3.3藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說(shuō)明。

10.4臨床試驗(yàn)：介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】

應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1 如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2 臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法:國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)[Z].

[2]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告:國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號(hào)[Z].

[3]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則:國(guó)家藥品監(jiān)督管理局2021年第72號(hào)[Z].

[4]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心.定性檢測(cè)體外診斷試劑分析性能評(píng)估注冊(cè)審查指導(dǎo)原則:國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心2022年第36號(hào)[Z].

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南2022年版. 傳染病信息，2023,36:1-17.